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    • 专利摘要:
    本發明係關於一種用以製備十胜肽地蓋瑞利、其保護前驅物及其它有用的中間產物之液(或溶液)相製造方法。本發明進一步關於在溶液相製造方法中有用的多胜肽，及關於地蓋瑞利其自身之純化。地蓋瑞利可藉由在有機溶劑中，讓根據式II的地蓋瑞利前驅物或其鹽或溶劑化物：(P1)AA1-AA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2 (II) 接受切割試劑處理而獲得；其中P1係胺基保護基團，較佳為乙醯基；P4係氫或羥基保護基團，較佳為羥基保護基團；P6係氫或胺基保護基團，較佳為胺基保護基團；及P8係胺基保護基團。
    公开号:TW201305186A
    申请号:TW100138937
    申请日:2011-10-26
    公开日:2013-02-01
    发明作者:Jon Holbech Rasmussen；Jens Fomsgaard；Stefan Hansen；Palle Hedengran Rasmussen；Wolfgang Oliver Wachs
    申请人:Ferring Bv；
    IPC主号:C07K7-00
    专利说明:
    用於製造地蓋瑞利(DEGARELIX)及其中間產物的方法(二) 技術領域
    本發明係關於一種用以製備十胜肽地蓋瑞利、其保護前驅物及其它有用的中間產物之液(或溶液)相製造方法。本發明進一步關於在該溶液相製造方法中有用的多胜肽，及關於地蓋瑞利其自身之純化。 發明背景
    前列腺癌係工業化世界中導致男性發病及致死的原因。地蓋瑞利(亦已知為FE200486)係第三代促性腺素釋素(GnRH)受體拮抗劑(GnRH阻斷劑)，其已經發展且最近已批准用於需要雄性激素去除療法(androgen ablation therapy)之前列腺癌患者(多恩(Doehn)等人，藥物(Drugs)，2006，vol. 9，No. 8，pp. 565-571；WO 09846634)。地蓋瑞利藉由在腦垂體中直接及競爭性阻斷GnRH受體而作用，且如其它GnRH拮抗劑般，不經由下視丘-腦垂體-性腺軸造成促黃體素製造之初始刺激，因此不造成睪固酮潮放或臨床熱紅(凡波佩(Van Poppel)，癌管理及研究(Cancer Management and Research)，2010：239-52；凡波佩等人，泌尿科學(Urology)，2008，71(6)，1001-1006)；詹姆斯(James)，E.F.等人，藥物，2009，69(14)，1967-1976)。
    地蓋瑞利係一種包含七種非天然胺基酸(其五種係D-胺基酸)的合成線性十胜肽。其在該十胜肽的骨架中具有十個對掌性中心。在該序列中的5位置處，於側鏈取代中之胺基酸殘基具有額外的對掌性中心，總共提供十一個對掌性中心。其CAS登記編號係214766-78-6(自由態鹽基)及其可以商標弗馬供(Firmagon)TM商業購得。該藥品物質化學標示為D-丙胺醯胺，N-乙醯基-3-(2-萘基)-D-丙胺醯基-4-氯-D-苯基丙胺醯基-3-(3-吡啶基)-D-丙胺醯基-L-絲胺醯基-4-[[[(4S)-六氫-2,6-二側氧-4-嘧啶基]羰基]胺基]-L-苯基丙胺醯基-4-[(胺基羰基)胺基]-D-苯基丙胺醯基-L-白胺醯基-N6-(1-甲基乙基)-L-離胺醯基-L-脯胺醯基-，及由下列化學結構表示(在下列中亦指為式I)：
    地蓋瑞利的結構亦可表示為：
    Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2
    其中Ac係乙醯基，2Nal係2-萘基丙胺酸，4Cpa係4-氯苯基丙胺酸，3Pal係3-吡啶基丙胺酸，Ser係絲胺酸，4Aph係4-胺基苯基丙胺酸，Hor係氫乳清酸基(hydroorotyl)，Cbm係胺甲醯基，Leu係白胺酸，Lys(iPr)係N6-異丙基離胺酸，Pro係脯胺酸及Ala係丙胺酸。
    為了描述本發明的目的，在地蓋瑞利中之每個胺基酸將提供如下的速記標記：AA1係D-2Nal，AA2係D-4Cpa，AA3係D-3Pal，AA4係Ser，AA5係4Aph(L-Hor)，AA6係D-Aph(Cbm)，AA7係Leu，AA8係Lys(iPr)，AA9係Pro及AA10係D-Ala。
    因此，作為實施例，地蓋瑞利可表示為Ac-AA1-AA10-NH2，四胜肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser可表示為Ac-AA1-AA4及六胜肽4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2如為AA5-AA10-NH2。
    地蓋瑞利先前已使用Boc-固相胜肽合成(SPPS)方法來製備，如在WO 98/46634及江(Jiang)等人，J. Med. Chem. 2001，44，453-467中所報導。基本上，首先在二甲基甲醯胺(DMF)/CH2Cl2中，使用二異丙基碳二醯亞胺(DIC)及1-羥基苯并三唑(HOBt)作為活化或偶合劑，將經Boc保護的D-Ala偶合至MBHA樹脂。一旦D-Ala偶合至該樹脂，藉由洗滌、去阻礙，然後偶合下一個胺基酸殘基繼續進行合成，直到已經完成十胜肽。在5-位置中的4Aph及在6-位置中的D-4Aph之側鏈主要胺基，當加入它們時，其係由Fmoc保護，及在該鏈中加入下一個胺基酸前各別以L-Hor及Cbm改質。此需要下列額外步驟：首先以哌啶移除該側鏈保護，讓該新近釋放在胜肽樹脂(peptidoresin)上的胺基與異氰酸三級丁酯或L-氫乳清酸反應，以寧海準檢驗保證該反應完成，然後，在加入下一個胺基酸殘基前洗滌該胜肽樹脂(亦參見梭貝拉(Sorbera)等人，未來藥物(Drugs of the Future)，2006，Vol. 31，No. 9，pp 755-766)。
    雖然Boc-SPPS方法至今已獲得足夠量的地蓋瑞利，對此多胜肽增加需求意謂著不斷需要較大的量。需要HF切割的Boc-SPPS不適合於大規模工業合成。更確切來說，WO 98/46634提到SPPS僅合適於最高1公斤的限制量，同時標準胜肽溶液合成或液相胜肽合成(LPPS)對較大量的產物來說係較佳。WO 98/46634未詳細指明此合成應該如何進行。雖然已經報導出存在有地蓋瑞利的液相胜肽合成[EMEA報導：對弗馬供TM(地蓋瑞利)的評估報導：Doc. Ref. EMEA/CHMP/635761/2008]，但截至現在，尚未公開地揭示出此方法之細節。
    WO 97/34923及WO 99/26964係關於用以製備生物活性的胜肽之液相方法的文件。WO 99/26964特別關於具有作為GnRH拮抗劑的活性之十胜肽的液相合成。WO 99/26964列出一些用來製造GnRH拮抗劑的SPPS方法之固有限制，包括該樹脂的限制容量、需要大過量的試劑及胺基酸、和需要保護全部反應性側鏈(諸如在Ser中的羥基、在Aph及D-Aph中的芳香族胺基、在Lys(i-Pr)中的ε-異丙基胺基)。
    WO 99/26964描述出一種液相方法，其包括首先製備十胜肽的5及6位置具有完全精製的側鏈之中心胜肽片段，然後經由“4-2-4”、“3-3-4”或“3-4-3”片段組合圖譜來組合該胜肽。例如，在GnRH拮抗劑阿剎林B(Azaline B)之製備時，讓一四胜肽與一六胜肽偶合來形成想要的十胜肽。當地蓋瑞利嘗試相同的片段組合圖譜時，絲胺酸胺基酸(AA4)的外消旋發生而產生約20%之L-Ser雜質。此雜質繼續存在至最後十胜肽中並難以移除。再者，當遵循在WO 99/26964中所描述的程序，將Ser單元加入至三胜肽AA1-AA3來製備四胜肽AA1-AA4時，來自苄基酯基團水解的四丁基銨離子會無法在隨後的操作期間完全移除且會被帶至最後產物。已進一步發現在地蓋瑞利合成時，當讓L-二氫乳清酸與4Amp偶合來製備AA5時，L-氫乳清酸基會重組成其尿囊素乙醯基類似物。地蓋瑞利之溶液相合成的這些及其它問題現在已克服，且於此第一次揭示出此十胜肽的新型溶液相多胜肽合成。 發明概要
    如在WO 97/34923及WO 99/26964中所描述之用來製備地蓋瑞利的SSPS方法之問題及LLPS方法的缺點現在已克服，且其係本發明之目標。
    通常來說，本發明係關於十胜肽地蓋瑞利之液相合成。
    在一個觀點中，本發明係關於一種用以製備具有式Ac-AA1-AA10-NH2的地蓋瑞利或其醫藥可接受的鹽或溶劑化物之液相方法，其包括讓根據下列式II的地蓋瑞利前驅物或其鹽或溶劑化物接受以切割試劑處理之步驟：
    因此，式II之化合物與下列相應：
    (P1)AA1-AA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2　(II)
    其中AA1至AA10與式(I)相同，P1係胺基保護基團或乙醯基；P4係氫或羥基保護基團，以羥基保護基團為較佳；P6係氫或胺基保護基團，以胺基保護基團為較佳；及P8係胺基保護基團。
    較佳的是，該保護基團P1(若存在的話)與P8正交，即，二保護基團可各自獨立地切割。
    在較佳的具體實例中，P1係乙醯基，及P4與P8每個係可在單一步驟中切割之保護基團，及P6係氫或可與保護基團P4及P8一起切割的保護基團。保護基團之切割係以藉由以三氟醋酸(TFA)處理式II的前驅物來進行為較佳。特別佳的是，P4、P6及P8保護基團係選自於三級丁基(tBu)及三級丁氧基羰基(Boc)，及最佳的式II之前驅物係其中P4係tBu，P6係氫或tBu，及P8係Boc。
    本發明亦關於一種用於由式(II)表示的中間產物或其醫藥可接受的鹽或溶劑化物之液相製造的方法，其包括在液體試劑媒質中，於胜肽偶合劑存在下，選擇性與有機胺鹼一起，偶合由式(III)表示的第一多胜肽或其鹽：
    (P1)AA1-AA2-AA3　(III)
    與由式(IV)表示的第二多胜肽或其鹽：
    AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2　(IV)
    以形成由式(II)表示的十胜肽之步驟。於此情況中，AA1至AA10、P4、P6及P8與式(II)相同。
    該鹽包括酸式鹽類，諸如鹽酸類；及鹼式鹽類，諸如鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽及銨鹽。
    根據本發明，由式(IV)表示的第二多胜肽可藉由從下列化合物(IVa)中消除保護基團PN來製備：
    (PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2　(IVa)
    PN係以N-終端胺基保護基團為較佳，及更佳的保護基團係可藉由氫化消去，諸如苄氧基羰基。
    式(IVa)之化合物可藉由偶合由式(V)表示的多胜肽與由式(VI)表示的多胜肽或這些化合物的鹽而獲得：
    (PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7　(V)
    AA8(P8)-AA9-AA10-NH2　(VI)
    其中AA4至AA10、PN、P4、P6及P8與式(IVa)相同。
    本發明亦關於在本發明之液相製造方法中有用之由式(II)至(VI)表示的多胜肽。 圖式簡單說明
    第1圖顯示出一用於該胜肽合成之AA1及AA2的衍生物之合成的流程圖。
    第2圖顯示出一用於該胜肽合成之AA2-AA3的衍生物之合成的流程圖。
    第3圖顯示出一用於Ac-AA1-AA3之合成的流程圖。
    第4圖顯示出一用於AA6-AA7之衍生物的合成之流程圖。
    第5圖顯示出一用於AA5-AA7之衍生物的合成之流程圖。
    第6圖顯示出一用於Z-AA4-AA7之合成的流程圖。
    第7圖顯示出一用於AA9-AA10之合成的流程圖。
    第8及9圖顯示出一用於Z-AA9-AA10之合成的流程圖。
    第10圖顯示出一用於Z-AA4-AA10之合成的流程圖。
    第11圖顯示出一用於式II之前驅物的合成之流程圖。
    第12圖顯示出一用於從式II之前驅物合成地蓋瑞利及純化及冷凍乾燥的流程圖。 發明之詳細說明
    現在，將更詳細地描述本發明。 去保護步驟
    在第一觀點中，本發明係關於一種用以製備具有式Ac-AA1-AA10-NH2的地蓋瑞利或其醫藥可接受的鹽或溶劑化物之液相方法。該方法包括在包含前驅物與一溶解在其中的切割試劑之有機溶液中，從根據式II((P1)AA1-AA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2)的地蓋瑞利前驅物或其鹽或溶劑化物中切割保護基團(P4)、(P6)及(P8)(若存在的話)之步驟。
    在式II中之AA1至AA10具有與在式(I)中相同的意義，及P1係胺基保護基團或乙醯基，以乙醯基為較佳。
    P8係胺基保護基團。較佳的是，P8係在技藝中已知的任何側鏈保護基團，諸如描述在E.葛羅斯(Gross)及J.梅恩厚弗(Meienhofer)，胜肽：分析、結構、生物學(The Peptides: Analysis,Structure,Biology)，第3冊：在胜肽合成中的官能基之保護(Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis)(學術出版社(Academic Press)，N.Y.，1981)中的那些。合適的實施例包括9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)、苄氧基羰基(Cbz或Z)及經取代的Cbz，諸如例如，2-溴-苄氧基羰基(2-Br-Z)、2-氯-苄氧基羰基(2-Cl-Z)、對-氯苄氧基羰基、對-6-硝基苄氧基羰基、對-溴苄氧基羰基及對-甲氧基苄氧基羰基、鄰-氯苄氧基羰基、2,4-二氯苄氧基羰基、2,6-二氯苄氧基羰基及類似基團；脂肪族胺基甲酸酯型式保護基團，諸如三級丁氧基羰基(Boc)、三級戊氧基羰基、異丙基氧基羰基、2-(對-聯苯基)-異丙基氧基羰基及類似基團；環烷基胺基甲酸酯型式保護基團，諸如環戊氧基羰基、金剛烷基氧基羰基及環己氧基羰基；烯丙基氧基羰基(Alloc)、乙醯基(Ac)、苄醯基(Bz)、三氟乙醯基(Tfa)、甲苯磺醯基(Tos)、苄基(Bn)、三苯基甲基(Trt)、鄰-硝基苯基-次磺酸基(Nps)、三級丁基-二甲基矽烷基氧基羰基、[2-(3,5-二甲氧基苯基)-丙基-2-氧基羰基](Ddz)、2,2,2-三氯乙基氧基羰基(Troc)、聯苯基異丙基氧基羰基(Bpoc)及鄰-硝基苄氧基羰基。較佳的保護基團有Fmoc、Boc及Alloc，且以Boc為最佳。
    P4係氫或羥基保護基團，以羥基保護基團為較佳。Ser(P4)的羥基以下列為較佳：C4-C6烷基(例如，三級丁基、環己基)、乙醯基(Ac)、三苯甲基、苄基、苄基醚(諸如對-甲氧基苄基)、或其它經取代的苄基(諸如對-硝基苄基、對-氯苄基、鄰-氯苄基及2,6-二氯苄基)、四氫哌喃基、三(C1-C6)烷基矽烷基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、4-二甲基胺甲醯基苄基及O-苯氧基乙醯基醚類。
    以三級丁基、苄基及9-茀基甲基醚類為特別佳，以三級丁基為最佳。
    P6係氫或胺基保護基團，以胺基保護基團為較佳。較佳的保護基團包括C4-C6烷基(例如，三級丁基、環己基)、乙醯基(Ac)、三苯甲基、苄基、苄基醚(諸如對-甲氧基苄基)、或其它經取代的苄基(諸如對-硝基苄基、對-氯苄基、鄰-氯苄基及2,6-二氯苄基)、四氫哌喃基、三(C1-C6)烷基矽烷基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、4-二甲基胺甲醯基苄基及O-苯氧基乙醯基醚類。以三級丁基、苄基及9-茀基甲基醚類為特別佳，以三級丁基為最佳。
    使用來移除保護基團的切割試劑依該保護基團之本質而定且在技藝中熟知。
    用於Ser羥基保護基團P4的較佳切割試劑有：
    ‧三氟醋酸(TFA)、HCl或甲磺酸，特別對三級丁基醚作為保護基團來說；
    ‧H2/Pd-C、HF或三氟甲磺酸，特別對苄基醚作為保護基團來說；及
    ‧SiCl4/苯基甲基醚，特別對2-(甲基亞碸基)苄基醚作為保護基團來說。
    用於胺基保護基團P8的較佳切割試劑有：
    ‧三氟醋酸(TFA)、HCl或甲磺酸，特別對胺基甲酸三級丁酯類作為保護基團來說；
    ‧H2/Pd-C、HF或三氟甲磺酸，特別對胺基甲酸苄酯類作為保護基團來說；及
    ‧哌啶、DBU及DEA，特別對Fmoc作為保護基團來說。
    較佳的溶劑包括DCM、DMF、NMP、二氧六圜、EtOH、純淨的HF及TFA。
    特別佳的不同切割條件指示在下列表1中：
    典型來說，在室溫(20至25℃)下，將式II之前驅物溶解於切割試劑(較佳為TFA，含或不含額外的溶劑)中20至30小時，較佳為24小時。當保護基團已經移除(以該轉換係>95%產率為較佳，最佳為>99%)時，然後，較佳為將地蓋瑞利粗產物傾入經緩衝的水-乙醇混合物中，以提供用於隨後的地蓋瑞利粗產物之純化的緩衝溶液。較佳的pH係在範圍2至4內為較佳，在範圍2.5至3.5內為更佳，及最佳為大約3。
    去保護步驟的特定具體實例顯示在第12圖及實施例4(參見步驟12)中。 純化及冷凍乾燥
    使用層析技術(諸如，製備型逆相層析法(RPC))來純化地蓋瑞利粗產物的溶液為較佳。
    然後，以冷凍乾燥所產生的產物為較佳。 3+7偶合
    在進一步觀點中，本發明亦關於一種用於由式(II)表示的中間產物或其醫藥可接受的鹽或溶劑化物之液相製造的方法，其包括在液體試劑媒質中，於胜肽偶合劑及選擇性有機胺鹼存在下，偶合由式(III)表示的第一多胜肽或其鹽：
    (P1)AA1-AA2-AA3　(III)
    與由式(IV)表示的第二多胜肽或其鹽：
    AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2　(IV)
    以形成由式(II)表示的十胜肽之步驟。於此情況中，AA1至AA10、P1、P4、P6及P8與式(II)相同。該鹽包括酸式鹽類，諸如鹽酸類；及鹼式鹽類，諸如鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽及銨鹽。
    在有機溶液(其中二種胜肽、胜肽偶合劑及選擇性有機胺鹼已溶解在其中)中進行該偶合反應。亦可存在有胜肽偶合添加劑及/或有機胺。
    該有機溶劑、胜肽偶合劑、胜肽偶合添加劑及有機胺鹼可為在LPPS技藝中已知的那些之任何。
    典型的有機溶劑有THF、NMP(N-甲基吡咯啶酮)、DCM、DMF、DMSO及其混合物。最佳的溶劑係DMSO。
    典型的胜肽偶合試劑有下列之一或多種：六氟磷酸鄰-(7-吖苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基(HATU)、六氟磷酸鄰-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基(HBTU)、四氟硼酸鄰-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基(TBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基胺基)鏻(BOP)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯啶鏻(PyBOP)、二氯化N,N-雙-(2-側氧-3-唑啶基)膦酸(BOP-Cl)、六氟磷酸溴-三-吡咯啶基-鏻(PyBroP)、異-丁基氯甲酸酯(IBCF)、1,3二環己基碳二醯亞胺(DCC)、1,3-二異丙基-碳二醯亞胺(DIC)、1-(二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸(WSCDI)、N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(EEDQ)、異丙基氯甲酸酯(IPCF)、四氟硼酸2-(5-降烯-2,3-二羧亞醯胺基)-1,1,3,3-四甲基(TNTU)、丙烷膦酸酐(PPAA)及四氟硼酸2-琥珀醯亞胺基-1,1,3,3-四甲基(TSTU)。
    較佳的偶合劑係DCC。以使用DCC而沒有有機胺為較佳。在特別佳的具體實例中，使用DCC與DMSO之組合。DCC的使用量為1.3至2係較佳，最佳為1.4至1.6當量(相關於三胜肽)。
    另一種較佳的偶合劑係DIC，其與6-氯-HOBt組合著使用，選擇性與銅鹽一起較佳。
    典型的胜肽偶合添加劑係1-羥基-1H-苯并三唑(HOBt)、6-氯-HOBt及1-羥基-7-吖苯并三唑(HOAt)。
    典型的有機胺鹼係NMM、DIPEA、TEA及柯林鹼。
    以使用DMSO作為溶劑及DCC作為偶合劑進行偶合反應為特別佳。
    該偶合步驟的特定具體實例顯示在第11圖及實施例4(參見步驟11)中。 七胜肽之合成
    以藉由消去下列化合物IVa的保護基團PN獲得式IV之化合物(即，AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2)為較佳：
    (PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2　(IVa)
    同時AA4至AA10、P4、P6及P8具有與上述相同的意義，PN係N-終端胺基保護基團。在較佳的具體實例中，PN係可藉由氫化反應(例如，使用氫及鈀觸媒(諸如Pd/C))消除的保護基團。最佳的保護基團PN係苄氧基羰基(Z)。
    PN的消除步驟之特定具體實例顯示在第11圖及實施例4(參見步驟11)中。
    可藉由偶合由式(V)表示的多胜肽與由式(VI)表示的多胜肽或這些化合物之一或二者的鹽獲得式(IVa)之化合物：
    (PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7　(V)
    AA8(P8)-AA9-AA10-NH2　(VI)
    其中AA4至AA10、P4、P6及P8與式(IVa)相同。在有機溶液(其中二種胜肽及胜肽偶合劑已溶解在其中)中進行該偶合反應。亦可存在有胜肽偶合添加劑及/或有機胺。可使用與上所述相同的胜肽偶合試劑、有機溶劑、胜肽偶合添加劑及有機胺。在較佳的具體實例中，使用DCC作為偶合劑，選擇性與醋酸乙酯作為溶劑。 式V之四胜肽的合成
    在較佳的具體實例中，藉由一包含下列步驟的方法來製備式V之四胜肽，即，(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7：
    (a)提供(PN2)AA5-AA6(P6)-AA7(PC)，其中P6具有與上述在式IVa中相同的意義，(PN2)係N-終端胺基保護基團或氫，及(PC)係可藉由氫化反應切割之C-終端羧基保護基團；
    (b)移除該胺基保護基團(PN2)，若存在的話；
    (c)氫化H-AA5-AA6(P6)-AA7(PC)以獲得H-AA5-AA6(P6)-AA7；及
    (d)讓H-AA5-AA6(P6)-AA7與(PN)AA4(P4)之經活化的酯反應以提供(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7，其中(P4)係羥基保護基團或氫，P6係氫或胺基保護基團，及PN係可較佳地藉由氫化反應(例如，使用氫及鈀觸媒(諸如Pd/C))消除的保護基團。
    最佳的保護基團PN係苄氧基羰基(Z)。
    較佳的(PN)AA4(P4)之經活化的酯係4-硝基苯基酯(ONp)。
    因此，較佳的是，移除在AA5-AA7中間產物中之苄基酯來提供N及C二者無保護的AA5-AA7。然後，讓此三胜肽與預活化的絲胺酸(例如，Z-Ser(tBu)-ONp)反應。 地蓋瑞利製造
    因此，本發明係關於地蓋瑞利之製造，上述討論的去保護步驟係此製造之基本步驟。在較佳的具體實例中，此去保護步驟接在上述討論的3+7偶合之後。在甚至更佳的具體實例中，3+7偶合接在上述討論的七胜肽之合成之後，即，該方法包括下列步驟：
    a)　合成AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2或其鹽或溶劑化物；
    b)　偶合AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2與(P1)AA1-AA2-AA3，以提供(P1)AA1-AA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2)或其鹽或溶劑化物；
    c)　去保護(P1)AA1-AA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2)或其鹽或溶劑化物，以提供地蓋瑞利或其溶劑化物或鹽。
    AA1至AA10及P1、P4、P6及P8具有與上述定義相同的意義。
    在特別佳的具體實例中，
    ‧P1係乙醯基；
    ‧P4係可以TFA切割的保護基團，以tBu為較佳；
    ‧P6係氫或可以TFA切割的保護基團，以tBu為較佳；
    ‧P8係可以TFA切割的保護基團，以Boc為較佳。
    在最佳的具體實例中，使用上述的七胜肽合成來製造七胜肽。再者，接在該去保護步驟後為上述的純化及冷凍乾燥方法係較佳。
    在地蓋瑞利或其前驅物之合成中，及特別在包含胜肽與氫乳清酸基部分的全部步驟中，該pH保持低於9為較佳，以低於8.5為較佳，甚至更佳為低於8。較佳的是，使用弱鹼(諸如NaHCO3)來調整pH。特別佳的是，在偶合步驟後之全部萃取皆在pH範圍2至9內進行，較佳為2.5至8(參見在實驗部分中的步驟6、7、10及11)。額外較佳的是，在萃取或洗滌步驟前加入及C4-5脂肪族醇(諸如，正丁醇或2-丁醇)。 中間產物
    本發明亦關於由式(II)至(VI)表示的多胜肽，其在本發明之液相製造方法中有用。
    式(II)的較佳具體實例
    (P1)AA1-AA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2　(II)
    較佳的具體實例包括這些化合物之鹽。 式(III)的較佳具體實例
    (PN)AA1-AA2-AA3　(III)
    表3
    較佳的具體實例包括這些化合物之鹽。 式(IV)/(IVA)的較佳具體實例
    (PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2　(IV)
    較佳的具體實例包括這些化合物之鹽。 式(V)的較佳具體實例
    (PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7　(V)
    較佳的具體實例包括這些化合物之鹽及溶劑化物。 式(VI)的較佳具體實例
    AA8(P8)-AA9-AA10-NH2　(VI)
    當保護基團不存在時，該官能基係該已去保護的基團(例如>NH)。
    較佳的具體實例包括這些化合物之鹽。 實驗部分 在實驗部分中所使用的材料
    下列列出在實驗部分中所使用的材料。 化學藥品：
    氨水溶液NH3(aq)
    乙腈C2H3N
    正丁醇C4H10O
    2-丁醇C4H10O
    異丙醇(異丙醇)C3H8O
    醋酸丁酯C5H12O2
    乙醇，99.9%C2H6O
    甲醇CH4O
    庚烷C7H16
    純水H2O
    醋酸乙酯C3H8O2
    醋酸C2H4O2
    醋酸銨C2H7NO2
    乙醯基咪唑C5H6N2O
    三乙基胺C6H15N
    N-甲基嗎福啉C5H11NO
    N-甲基吡咯啶酮C5H9NO
    N,N’-二環己基碳二醯亞胺C13H22N2
    二環己胺C12H22N
    N,N’-二異丙基碳二醯亞胺C7H14N2
    N,N-二甲基乙二胺C4H12N
    N,N-二甲基甲醯胺C3H7NO
    二甲基亞碸C2H6OS
    1-羥基苯并三唑C6H5N3O
    對-硝基酚C6H5NO3
    N-羥基琥珀醯亞胺C4H5NO3
    氯甲酸異丁酯C5H9ClO2
    氯化鈉NaCl
    氫氧化鈉，NaOH水溶液(aq)
    鹽酸，HCl水溶液(aq)
    磷酸H3PO4
    氫硫酸鈉NaHSO4
    碳酸氫鈉NaHCO3
    甲磺酸CH4SO3
    三氟醋酸C2HF3O2
    鈀在活性碳上，5%Pd-C
    氫H2
    甲苯C7H8 起始材料：
    實施例1：中間產物Ac(1-3)ONa：Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-ONa[7]之合成 Boc-D-4Cpa-OH之活化及分離 步驟1(反應步驟)
    將Boc-D-4Cpa-OH(299.75克)溶解在iPrOH(3.53公斤)中，攪拌該混合物且加入HOSu(0.184公斤)及DIC(0.164公斤)，及在0℃下攪拌1小時。過濾出析出物及以iPrOH清洗。在減壓下乾燥該固體以產生Boc-D-4Cpa-OSu[1]。 Boc-D-2Nal-OH之活化及分離 步驟2(反應步驟)
    將Boc-D-2Nal-OH(315.38克)溶解在iPrOH(5.35公斤)中，並加入IBC(157.07克)及NMM(116.7克)。在冷卻至-10℃後，與額外的NMM(10.11克)一起加入水(42毫升)、iPrOH(1.1公斤)與HOSu(230.14克)之混合物，及攪拌該混合物30分鐘。加入水(0.82升)及過濾出析出物，及以iPrOH清洗及在減壓下乾燥，以產生Boc-D-2Nal-OSu[2]。 Boc(2-3)OH：Boc-D-4Cpa-D-3Pal-OH之合成 步驟3(反應步驟)
    將來自步驟1的H-D-3Pal-OH×2HCl(0.251公斤)及Boc-D-4Cpa-OSu[1](0.397公斤)溶解在DMSO(3.33升)中，並加入NMM(318.8克)。在20℃下攪拌該混合物6小時。加入水(17升)及藉由加入HCl將pH調整至pH 4.25。過濾出析出物及將其分散在水中。然後，過濾所獲得的料漿及以水清洗。在減壓下乾燥該固體以產生Boc-D-4Cpa-D-3Pal-OH[3]。 中間產物Ac(1-3)ONa：Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-ONa[7](式IIIa之化合物)之合成 步驟4(反應步驟)
    將來自步驟3的Boc-D-4Cpa-D-3Pal-OH[3](447.93克)溶解在AcOEt(3.4升)與AcOH(675毫升)之混合物中，在加入MSA(672.77克)後於5℃下冷卻該混合物。在10℃下繼續該反應2小時，及在該溶液中加入TEA(1214.28克)以產生H-D-4Cpa-D-3Pal-OH[4]。
    將來自步驟2的Boc-D-2Nal-OSu[2](412.44克)加入至H-D-4Cpa-D-3Pal-OH[4]，在20℃下攪拌24小時。加入25%NH3水溶液(0.154升)及正丁醇(4.5升)，且在45℃下攪拌該混合物1小時。
    以下列物質清洗該溶液：
    ‧水
    ‧在pH 9.5下的水(以NaOH水溶液調整pH，同時攪拌)
    ‧水
    將AcOH(4.5升)加入至有機相及在減壓下將該溶液濃縮成油。將該油再溶解於AcOH(4.5升)中及在減壓下再濃縮，以產生Boc-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH[5]，如為油。
    將Boc-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH[5]溶解在水(0.09升)及AcOH(1.8升)中。加入MSA(672.77克)及在低於35℃下攪拌該混合物2小時。以TEA(779.16克)中和該溶液。在減壓下將該溶液濃縮成油。將該油再溶解於甲苯(2.5升)中及在減壓下再濃縮成油。重覆最後步驟以產生H-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH[6]。
    將H-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH[6]溶解於甲苯(2.0升)中，及加入乙醯基咪唑(132.14克)在甲苯(0.25升)中的溶液。在20℃下攪拌該溶液2小時，及加入水(0.1升)。
    加入正丁醇(4.5升)且在35℃下以下列物質清洗該有機混合物：
    ‧5% NaCl水溶液
    ‧甲醇及在酸性pH 5.5下的水(以NaOH水溶液調整pH，同時攪拌)
    ‧甲醇及在pH 11下的水(以NaOH水溶液調整pH，同時攪拌)
    ‧甲醇及10%NaCl水溶液
    在20℃下，於來自萃取之攪拌的有機相中加入庚烷(15升)1小時，且將所產生的懸浮液遺留在20℃下1小時，伴隨著攪拌。藉由過濾分離析出物，並將其懸浮在庚烷(3.5升)中。再次過濾懸浮液。重覆最後使用庚烷的洗滌步驟及過濾。然後，在減壓下乾燥該固體以產生Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-ONa[7]。 關鍵中間產物的規格 步驟4　中間產物Ac(1-3)ONa[7]
    實施例2：中間產物Z(4-7)OH×DCHA：Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH×DCHA[15]之合成 中間產物Boc(6-7)OBzl：Boc-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl之合成 步驟5(反應步驟)
    將Boc-D-4Aph(tBuCbm)-OH(379.45克)溶解在NMP(0.76升)及AcOEt(4.4公斤)中。於-4℃下冷卻後，加入IBC(150.2克)及NMM(101.1克)，且在-7℃下攪拌該溶液0.5小時以產生Boc-D-4Aph(tBuCbm)-OAct[8]。
    將H-Leu-OBzl×TOS(491.88克)溶解在NMP(1.5升)中並加入AcOEt(2.7公斤)，接著NMM(126.4克)。隨後，將此溶液轉移至Boc-D-4Aph(tBuCbm)-OAct[8]，及在-10℃下攪拌1小時。然後，加入水(0.5升)。
    在20℃下，以下列物質清洗該反應混合物：
    ‧在pH 8.5下的水(以NaOH水溶液調整pH，同時攪拌)
    ‧在pH 2.0下的水(以HCl水溶液調整pH，同時攪拌)
    ‧水
    在減壓下將該有機相濃縮成油。將該油再溶解於AcOEt(0.6公斤)及在減壓下再濃縮成油。將剩餘的油溶解在AcOEt(0.6公斤)中。加入庚烷(15.5升)，同時在20℃下攪拌。藉由過濾分離析出物，及以庚烷清洗，隨後在減壓下乾燥，以產生Boc-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl[9]。 Boc-(5-7)-OBzl：Boc-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl之合成 步驟6(反應步驟)
    將來自步驟5的Boc-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl[9](582.7克)溶解在AcOEt(3.15公斤)中。加入MSA(481克)，且低於15℃攪拌5小時，及加入TEA(406克)。加入DMF(0.333公斤)接著TEA(101克)及NMM(51克)，以產生H-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl[10]。
    將Boc-4Aph(L-Hor)-OH(462.46克)溶解在DMF(2.09公斤)及AcOEt(1.44公斤)中。加入IBC(150.24克)及NMM(111.27克)，及在-10℃下攪拌0.5小時以產生Boc-4Aph(L-Hor)-OAct[11]。
    將H-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl[10]加入至Boc-4Aph(L-Hor)-OAct[11]，及在-10℃下攪拌1.5小時。然後，加入AcOEt(5.4公斤)及正丁醇(6.0升)。
    在20℃下，以下列物質清洗有機相：
    ‧在約pH 8下的5% NaHCO3水溶液(以NaHCO3水溶液調整pH，同時攪拌)
    ‧在pH 2.5下的10%NaCl水溶液(以H3PO4水溶液調整pH，同時攪拌)
    將DMF(0.9升)加入至有機相，然後在減壓下將其濃縮成油。將該溶液傾入水(14升)中，同時攪拌。在過濾器上分離析出物，及以水清洗。在減壓下乾燥該固體，以產生Boc-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl[12]。 中間產物Z(4-7)OH×DCHA：Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH×DCHA(式Va之化合物)之合成 步驟7(反應步驟)
    將來自步驟6的Boc-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl[12](885.02克)加入至MSA(961.1克)與AcOEt(7.2公斤)之混合物，及加入2-丁醇(2升)，及在0℃下攪拌所得的混合物6小時。然後，以TEA(909.0克)中和MSA。
    加入已分散在2-丁醇(1升)中的5%Pd/C(88.5克)，及在壓力下，於20℃下氫化該混合物3小時。然後，過濾掉Pd/C，及以2-丁醇清洗以產生包含H-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH[13]的溶液。
    將Z-Ser(tBu)-OH(413.5克)溶解在MeCN(2.5升)中及將該溶液冷卻至-5℃。
    加入HONp(195克)接著DCC(278.5克)，及在20℃下攪拌該混合物24小時。然後過濾該混合物，及以MeCN清洗以產生Z-Ser(tBu)-ONp[14]。將NMM(354.2克)、DMF(4.75公斤)及Z-Ser(tBu)-Onp[14]加入至該H-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH[13]溶液，及將該混合物遺留在20℃下伴隨著攪拌3天。
    以下列物質清洗所得的混合物：
    ‧在pH 2.5下的10%NaCl水溶液(以HCl水溶液調整pH，同時攪拌)
    ‧在酸性pH(pH 2.5)下的水(以HCl水溶液調整pH，同時攪拌)
    ‧7.5% NaHCO3水溶液
    ‧在(pH 2.5)下的5%NaCl水溶液(以HCl水溶液調整pH，同時攪拌)
    ‧10%NaCl水溶液
    在最後的有機相中加入DCHA(181克)，及在減壓下將該有機相濃縮成油。將該油再溶解於iPrOH(3.14公斤)中及在減壓下再濃縮成油。將剩餘的油再溶解於iPrOH(3.14公斤)，及當攪拌時將該溶液傾入AcOEt(31.5公斤)中。在20℃下繼續攪拌1小時直到析出，然後藉由過濾分離析出物，及以AcOEt清洗。在減壓下，於30℃下乾燥該固體30小時，以產生Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH×DCHA[15]。中間產物Z(4-7)OH×DCHA[15]的純度係80%(HPLC)。 步驟7　中間產物Z(4-7)OH[15]
    實施例3：中間產物H(8-10)NH2：H-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[21]之合成 Boc(9-10)NH2：Boc-Pro-D-Ala-NH2之合成 步驟8(反應步驟)
    將Boc-Pro-OH(226.02克)溶解在iPrOH(1.73公斤)中。將該反應混合物冷卻至-5℃。加入IBC(143.4克)及NMM(106.2克)且在5℃下攪拌該混合物0.5小時，以產生Boc-Pro-OAct[16]。
    將H-D-Ala-NH2×HCl(124.57克)懸浮在iPrOH(1.57公斤)與NMM(106.2克)之混合物中。將該懸浮液加入至Boc-Pro-OAct[16]。將該反應混合物遺留在10℃下伴隨著攪拌3小時。然後，加入DMEDA(10.6毫升)。過濾該混合物，及在減壓下將該濾出液濃縮成油。以AcOEt(1.125公斤)再溶解該油及再濃縮。
    將剩餘的油溶解於AcOEt(1.8公斤)與正丁醇(0.6升)之混合物中。以下列清洗該有機相：
    ‧在pH 2.5下的15%NaCl水溶液(以HCl水溶液調整pH，同時攪拌)
    ‧在pH 9.5下的15%NaCl水溶液(以NaOH水溶液調整pH，同時攪拌)
    在減壓下濃縮該有機相，將其再溶解於AcOEt(1.08公斤)及再濃縮成油。
    在20℃下加入AcOEt(0.33公斤)與庚烷(0.75升)之混合物及攪拌16小時。過濾所產生的析出物，及在過濾器上以AcOEt與庚烷之混合物清洗。然後，在減壓下乾燥該固體以產生Boc-Pro-D-Ala-NH2[17]。 中間產物H(8-10)NH2：H-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2(式VIa之化合物)之合成 步驟9(反應步驟)
    將來自步驟8的Boc-Pro-D-Ala-NH2[17](313.89克)溶解在MSA(528.61克)與iPrOH(0.785公斤)之混合物中，及在45℃下攪拌該溶液1小時。然後，以TEA(607.14克)中和該混合物以產生H-Pro-D-Ala-NH2[18]。
    將Z-Lys(iPr,Boc)-OH×DCHA(603.83克)懸浮在AcOEt(1.17公斤)中及以下列物質清洗：
    ‧12% NaHSO4水溶液
    ‧水
    ‧15%NaCl水溶液
    將來自萃取的Z-Lys(iPr,Boc)-OH[19]之有機相加入至H-Pro-D-Ala-NH2[18]。加入溶解在AcOEt(0.135公斤)中的HOBt(183.79克)及DCC(227.0克)，及在20℃下攪拌該混合物0.5小時。然後，加入水(0.2升)。過濾該混合物及以AcOEt清洗。在減壓下將結合的濾出液濃縮成油。將該油溶解在AcOEt(0.9公斤)中、過濾及以下列物質清洗該溶液：
    ‧在pH 2.5下的水(以HCl水溶液調整pH，同時攪拌)
    ‧在pH 9下的水(以NaOH水溶液調整pH，同時攪拌)
    ‧在pH 7下的10%NaCl水溶液(以HCl水溶液或NaOH水溶液調整pH，同時攪拌)
    在減壓下濃縮該有機相以產生Z-Lys(iPro,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[20]。
    將Z-Lys(iPro,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[20]溶解在乙醇(0.04公斤)及水(0.5升)中，及加入5%Pd/C(50克)。藉由加入6M HCl將該料漿酸化至pH 2.5及在20℃下氫化。在反應完成後，藉由過濾移除觸媒及藉由加入32%NaOH將pH提高至pH 7.0。隨後，藉由在減壓下蒸餾移除乙醇。將正丁醇(1升)加入至所產生的水相及以NaOH水溶液將pH調整至鹼性pH 9，及萃取開始。重覆此步驟。在減壓下將結合的有機相濃縮成油。
    將該油溶解在AcOBu(0.5升)中，在減壓下，於20℃下濃縮及將其再溶解於AcOBu(0.5升)中。然後，在50℃下加入庚烷(2升)1小時。將該懸浮液遺留在0℃下伴隨著攪拌16小時。藉由過濾分離析出物及以庚烷清洗。最後，在減壓下乾燥該固體以產生H-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[21]。中間產物H(8-10)NH2[21]的純度係95%(HPLC)。 步驟9　中間產物H(8-10)NH2[21]
    實施例4：斷片縮合成最後中間產物(式II之化合物) 中間產物Z(4-10)NH2：Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[22](式IVg之化合物) 步驟10(反應步驟)
    將來自步驟7的Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH×DCHA[15](1153.41克)溶解在DMF(2.1公斤)中。然後，一起加入HOBt(153.2克)與AcOEt(6.9公斤)及來自步驟9的H-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[21](569.5克)。當全部固體溶解時，加入MSA(96.1克)。將該溶液冷卻至低於5℃及加入已溶解在AcOEt(0.810公斤)中之DCC(309.5克)。將溫度提高至20℃及持續該反應24小時。Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH×DCHA[15]之轉換係96%(HPLC)。加入AcOEt(4.95公斤)及水(5.5升)，及攪拌該混合物，及過濾。當攪拌時，將7.5%NaHCO3(aq)(35升)加入至該濾出液。分離該等相及進一步以下列物質清洗有機層：
    ‧7.5%NaHCO3
    ‧在pH 3下的水(以HCl水溶液調整pH，同時攪拌)
    ‧水
    在減壓下將該最後有機相濃縮成油。將該油與EtOH(0.405公斤)再濃縮及隨後與AcOEt(0.45公斤)。將剩餘的油溶解在EtOH(0.405公斤)中，及加入AcOEt(0.45公斤)與AcOBu(4.6升)。在20℃下，將該溶液加入至庚烷(27.6升)1小時。然後，過濾析出物及以庚烷清洗。在最大的減壓下乾燥該固體，以產生Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-A.a-NH2[22]。Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[22]之純度係70%(HPLC)。 最後的中間產物Ac(1-10)NH2：Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[24] 步驟11(反應步驟)
    將來自步驟10的Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[22](1409.67克)加入至EtOH(10.98公斤)與水(3.2升)之混合物，並攪拌直到該溶液均勻。加入5%Pd/C(211克)。在20℃下氫化該混合物，伴隨著以HCl水溶液將pH控制在pH 2.5。
    藉由過濾移除觸媒及以NaOH水溶液將pH調整至pH 3.8。在減壓下將該濾出液濃縮成油。將EtOH(4.7公斤)加入至該油及再濃縮。然後，將AcOEt(5.4公斤)加入至該油及再濃縮，及再次重覆此方法以產生H-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[23]。
    將H-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[23]分散在AcOEt(1.125公斤)中，然後加入HOBt(153.16克)及將該混合物冷卻至0℃。將來自步驟4的Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-ONa[7](609.05克)溶解在DMSO(2.5升)中，將此溶液與包含H-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[23]的料漿混合，及加入已溶解在AcOEt(0.45公斤)中的DCC(309.5克)。在5℃下攪拌該混合物24小時。[23]之轉換係96%(HPLC)。
    加入水(150毫升)及DMSO(0.5升)，且繼續在20℃下攪拌多於3小時。過濾析出物，及以AcOEt與DMSO之混合物清洗。結合濾出液，及加入正丁醇(17升)。以下列物質清洗該有機溶液：
    ‧在pH 2.5下的水(以HCl水溶液調整pH，同時攪拌)
    ‧7%NaHCO3(aq)
    ‧10%NaCl水溶液(以HCl水溶液中和在該混合物中的pH至pH 7.0(若需要的話)，同時攪拌)
    加入DMF(4.75公斤)及在減壓下將該有機相濃縮成油。在20℃下，在強烈攪拌下，將該油慢慢加入至水(50升)1小時。在過濾器上分離析出物及以水清洗兩次。隨後，在減壓下乾燥該固體以產生Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[24][最後的中間產物]。[24]的純度係70%(HPLC) 實施例5：最後中間產物Ac(1-10)NH2之去保護成地蓋瑞利粗產物[25] 步驟12(反應步驟)
    在20℃下，將來自步驟11的Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[24](式IIb之化合物)(1844.59克)溶解在TFA(28.3公斤)中。在20℃下攪拌該溶液(移除3個保護基團)24小時。[24]的轉換係99%(HPLC)。
    然後，讓該反應混合物與水(74升)、AcONH4(19.1公斤)、AcOH(18.4升)及EtOH(14.52公斤)的冷溶液(低於10℃)混合。在二種溶液的混合期間，將溫度保持低於25℃。以TFA或AcONH4將最後溶液的pH調整至pH 3(若需要的話)，以產生Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2[25][地蓋瑞利粗產物]之溶液。 步驟13(純化及冷凍乾燥)
    將地蓋瑞利粗產物的溶液泵過逆相管柱。以梯度EtOH/在水中0.12%TFA從管柱中沖提地蓋瑞利。在逆相管柱上，使用梯度EtOH/在水中1%AcOH再純化具有純度95%之餾分。冷凍乾燥高純度的餾分。
    第1圖顯示出一用於該胜肽合成之AA1及AA2的衍生物之合成的流程圖。
    第2圖顯示出一用於該胜肽合成之AA2-AA3的衍生物之合成的流程圖。
    第3圖顯示出一用於Ac-AA1-AA3之合成的流程圖。
    第4圖顯示出一用於AA6-AA7之衍生物的合成之流程圖。
    第5圖顯示出一用於AA5-AA7之衍生物的合成之流程圖。
    第6圖顯示出一用於Z-AA4-AA7之合成的流程圖。
    第7圖顯示出一用於AA9-AA10之合成的流程圖。
    第8及9圖顯示出一用於Z-AA9-AA10之合成的流程圖。
    第10圖顯示出一用於Z-AA4-AA10之合成的流程圖。
    第11圖顯示出一用於式II之前驅物的合成之流程圖。
    第12圖顯示出一用於從式II之前驅物合成地蓋瑞利及純化及冷凍乾燥的流程圖。
    权利要求:
    Claims (13)
    [1] 一種用以製備具有式Ac-AA1-AA10-NH2的地蓋瑞利或其醫藥上可接受的鹽或溶劑化物之液相方法，其中AA1係D-2Nal，AA2係D-4Cpa，AA3係D-3Pal，AA4係Ser，AA5係4Aph(L-Hor)，AA6係D-Aph(Cbm)，AA7係Leu，AA8係Lys(iPr)，AA9係Pro及AA10係D-Ala，其包括讓根據式II之地蓋瑞利前驅物或其鹽或溶劑化物接受切割試劑處理的步驟： 其中P1係胺基保護基團，或較佳為乙醯基；P4係氫或羥基保護基團，較佳為羥基保護基團；P6係氫或胺基保護基團，較佳為胺基保護基團；且P8係胺基保護基團。
    [2] 如申請專利範圍第1項之方法，其中P1係乙醯基，P4係羥基保護基團，P6係氫或胺基保護基團，且P8係胺基保護基團。
    [3] 如申請專利範圍第2項之方法，其中P1係乙醯基，P4係tBu，P6係氫或tBu，且P8係Boc。
    [4] 一種用於以液相製造由式(II)表示的十胜肽或其醫藥上可接受的鹽或溶劑化物的方法：(P1)AA1-AA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(II)其中AA1係D-2Nal，AA2係D-4Cpa，AA3係D-3Pal，AA4係Ser，AA5係4Aph(L-Hor)，AA6係D-Aph(Cbm)，AA7係Leu，AA8係Lys(iPr)，AA9係Pro，AA10係D-Ala；P1係胺基保護基團或乙醯基；P4係氫或羥基保護基團，較佳為羥基保護基團；P6係氫或胺基保護基團，較佳為胺基保護基團；且P8係胺基保護基團；其包括在液體試劑媒質中，於胜肽偶合劑存在下，將由式(III)表示的第一多胜肽或其鹽：(P1)AA1-AA2-AA3　(III)與由式(IV)表示的第二多胜肽或其鹽偶合之步驟：AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2　(IV)。
    [5] 如申請專利範圍第4項之方法，其中P1係乙醯基，P4係羥基保護基團，P6係氫或胺基保護基團，且P8係胺基保護基團。
    [6] 如申請專利範圍第4或5項之方法，其係接續進行如申請專利範圍第1至3項中之任何一項的方法。
    [7] 一種用於製備由式(IV)表示之多胜肽的方法：(P4)AA4-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2　(IV)其中P4係氫或羥基保護基團，較佳為羥基保護基團；P6係氫或胺基保護基團，較佳為胺基保護基團；且P8係胺基保護基團；該方法係藉由偶合一由式(V)表示的多胜肽或其鹽或溶劑化物，與一由式(VI)表示的多胜肽或其鹽或溶劑化物，(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7　(V)AA8(P8)-AA9-AA10-NH2　(VI)然後移除該去保護基團PN，其中AA4至AA10、P4、P6及P8係與申請專利範圍第1項相同，且PN係一可藉由氫化反應移除的保護基團。
    [8] 如申請專利範圍第7項之方法，其中PN係苄氧基羰基，該苄氧基羰基可藉由於Pd/C觸媒存在下氫化該化合物(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2來移除。
    [9] 如申請專利範圍第7或8項之任何一項的方法，其係接續進行如申請專利範圍第4至6項之任何一項的方法。
    [10] 一種用以製造(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7之化合物的方法，其中AA4至AA7、P4及P6係與申請專利範圍第1項相同，且PN係一可藉由氫化反應移除的保護基團，該方法包括下列步驟：(a)　提供(PN2)AA5-AA6(P6)-AA7(PC)，其中P6具有與上述相同的意義，(PN2)係N-端胺基保護基團或氫，且(PC)係可藉由氫化反應切割的C-端羧基保護基團；(b)　若該胺基保護基團(PN2)存在的話，將其移除；(c)　氫化H-AA5-AA6(P6)-AA7(PC)以獲得H-AA5-AA6(P6)-AA7；及(d)　將H-AA5-AA6(P6)-AA7與(PN)AA4(P4)之經活化的酯反應以提供(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7，其中AA4具有與上述相同的意義，(P4)係羥基保護基團或氫，且PN係可較佳地藉由氫化反應消除的保護基團。
    [11] 如申請專利範圍第10項之方法，其中該地蓋瑞利溶液係藉由如申請專利範圍第1至3項中之任何一項的方法獲得。
    [12] 如前述申請專利範圍之一或多項的方法，其中該pH係保持在低於9，較佳為低於8。
    [13] 一種由下列式表示的多胜肽化合物或其鹽或溶劑化物：(P1)AA1-AA2-AA3，AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2，(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2，(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7，AA8(P8)-AA9-AA10-NH2，(P1)AA1-AA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2，其中AA1係D-2Nal，AA2係D-4Cpa，AA3係D-3Pal，AA4係Ser，AA5係4Aph(L-Hor)，AA6係D-Aph(Cbm)，AA7係Leu，AA8係Lys(iPr)，AA9係Pro，AA10係D-Ala；P1係胺基保護基團或乙醯基；P4係氫或羥基保護基團，較佳為羥基保護基團；P6係氫或胺基保護基團，較佳為胺基保護基團；P8係胺基保護基團；且PN係保護基團。
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